19 de Agosto de 2015

De la neurona al genoma: 30 años de cabezas de pescado
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Miguel L Allende
Director
Centro FONDAP de Regulación del Genoma
Facultad de Ciencias
Universidad de Chile
mallende@uchile.cl

La biología en el último medio siglo ha estado marcada por hallazgos significativos y
sorprendentes que nos han revelado la relación entre la información genética y la fisiología de las
células. El necesario reduccionismo que imperó en este periodo nos proporcionó una imágen
detallada de las complejas redes de interacción entre las moléculas que sostienen la vida. Sin
embargo, es claro que la descripción de estos fenómenos careció de una visión más holística que
los contextualizara al nivel del organismo, quien es, finalmente, el que debe interactuar con el
ambiente y es sujeto de la evolución. Esta inquietud me llevó a pensar en una carrera científica
que abarcara, en lo posible, los diversos niveles de organización biológica, desde el DNA hasta el
fenotipo, para tratar de encontrar una explicación a cómo surgen las formas macroscópicas.
Esencialmente, la inquietud me llevó a la genética molecular del desarrollo que, al comenzar mis
años formativos, empezó a nutrirse de una serie de disciplinas previamente inconexas: la
embriología, la genética, la biología molecular y la biología evolutiva. Heredé (literalmente) un
volúmen1 con los más recientes hallazgos en el área y me fasciné con los genes homeóticos, cuyas
mutaciones producen monstruosas aberraciones en el patrón del desarrollo de Drosophila
melanogaster. En el año 1985 no había ningún laboratorio trabajando en este tema en Chile como
me lo expresó el Prof. Luis Izquierdo, pero él me animó a conversar con el Prof. Nibaldo
Inestrosa quien estaba haciendo algunos experimentos con Drosophila en aquel entonces. Si bien,
nunca trabajé con las moscas, en el laboratorio del Dr. Inestrosa me entusiasmé con la
neurobiología y terminé haciendo mi tesis de pregrado en la expresión de los neurofilamentos en
el cerebro de la rata.
Dada la complejidad de hacer un postgrado en Chile en ese tiempo, emigré a EEUU y fuí
admitido en el programa doctoral en biología molecular de la University of Pennsylvania. Me
integré al laboratorio del Dr. Eric Weinberg, quien estudiaba la regulación transcripcional en
embriones de erizo, un modelo de estudio muy versátil debido a la facilidad para la
microinyección de constructos de expresión y a la gran cantidad de material disponible para la
purificación de factores de transcripción. Sin embargo, mi proyecto de tesis fracasó rotúndamente
al cabo de un año de trabajo y el Dr. Weinberg me sugirió cambiar de tema dándome la libertad
para elegir a mi gusto. Fue en ese momento cuando descubrí (por un par de publicaciones y mi
asistencia al curso de biología del desarrollo en Woods Hole el año 1988) al pez cebra, Danio rerio,
un modelo vertebrado que recién estaba comenzando a usarse en biología del desarrollo y en
genética; prometía ser una especie de Drosophila entre los vertebrados por su susceptibilidad a ser
mutagenizado y por la belleza de sus embriones, completamente transparentes y con un
desarrollo vertiginosamente rápido. El Dr. Weinberg me animó a instalar unos acuarios (muy
artesanales) en el laboratorio y empecé a criar mis primeros peces, que fueron comprados en una
tienda de mascotas en West Philadelphia. A partir de ellos, generé una genoteca e intenté obtener
clones de genes que fueran homólogos a aquellos que en Drosophila regulan la diferenciación
neuronal. Obtuvimos genes ortólogos de Achaete-scute y orthodenticle, factores de transcripción que
mostraron patrones de expresión altamente específicos en el cerebro embrionario de pez cebra (o
si Ud. prefiere, en la cabeza de pescado); también clonamos el gen myod, regulador maestro de la
diferenciación muscular. En aquel tiempo, se secuenciaba el DNA manualmente por la
metodología de Sanger, y gran parte de mi trabajo de tesis consistió en correr grandes y delgados
geles de poliacrilamida que, al más mínimo descuido, se arrugaban o rompían
irrecuperablemente, y luego leer y anotar en un cuaderno -con suerte- 100 a 200 bases de
secuencia. Para poder aprender a usar el modelo de pez cebra, realicé en 1990-1991 dos estadías
en los laboratorios líderes en el área, una en la Universidad de Oregon con el Dr. Monte
Westerfield, y la otra con la Dra. Christianne Nüsslein-Volhard en el Instituto Max Plank de
Tübingen, Alemania. En este último laboratorio, se habían embarcado en una mutagénesis
completa del genoma de pez cebra, siguiendo la estrategia que la misma Nüsslein-Volhard había
hecho a principios de los ’80 en Drosophila y de donde salieron la gran mayoría de los mutantes de
patrón embrionario de la mosca (la Dra. Nüsslein-Volhard compartió el Premio Nobel en 1995
por el descubrimiento de esa colección de genes de establecimiento de patrón en Drosophila). Este
era el tipo de aproximación que yo consideraba más informativa, ya que se hacía mutagénesis al
azar y se buscaban genes interesantes a partir de los fenotipos observados, sin el sesgo de conocer
a priori los genes. Paricipé en la búsqueda de mutantes en el grupo de Nüsslein-Volhard y
caractericé algunos de ellos usando hibridación in situ con las sondas de los genes que había
clonado en mi tesis; esto me permitió ser autor en dos de los artículos del laboratorio que se
publicaron en 1996 en la revista Development, en un número dedicado íntegramente a este
experimento masivo2. El resultado de este esfuerzo fue una colección de 2000 mutantes de los
cuales alrededor de 300 mostraban fenotipos de patrón embrionario o defectos tejido específicos.
La experiencia de Tübingen me convenció de hacer un postdoctorado en genética de pez
cebra ya que me parecía crítico poder estudiar los genes no por su expresión o rol molecular, sino
por el efecto que tienen sobre el desarrollo o función del organismo. La Dra. Nancy Hopkins,
viróloga del MIT en Boston, estaba interesada en realizar mutagénesis en pez cebra pero
encontraba frustrante que no fuera posible identificar molecularmente los genes mutados. En
efecto, de la colección de miles de mutantes obtenidos por Nüsslein-Volhard, sólo un puñado de
los genes afectados fueron clonados (obviamente, estábamos en la era pre-genómica). La Dra.
Hopkins me invitó en 1994, como investigador postdoctoral, a formar parte de un equipo que
armó con el propósito de generar mutantes insercionales en el pez, de manera análoga a lo que
se había desarrollado en Drosophila con los elementos P (transposones de DNA) o en Arabidopsis
thaliana con el DNA-T. La idea consistía en interrumpir genes mediante la integración al azar de
DNA exógeno, lo que serviría de marca molecular para encontrar rápidamente los genes
endógenos afectados. Era un proyecto ambicioso, pues la transgénesis en pez cebra estaba en su
infancia y no existían vectores de alta eficiencia que permitieran realizar inserciones al azar en el
genoma. Por otro lado, unos pocos mutantes serían de valor en el sentido que cada uno de ellos
podría analizarse molecularmente y se podría establecer la relación del gen y su producto con el
fenotipo observado. El grupo de seis personas que participamos en el proyecto tardó dos años en
obtener una metodología confiable de mutagénesis insercional. Consistió en generar partículas
retrovirales murinas (MLV) seudotipadas, que en su membrana llevaban glicoproteínas de un
virus de amplio espectro (VSV), lo que permitía que infectaran células de cualquier especie,
incluidos los peces. Produjimos virus con un altísimo título, lo que permitió además, infectar
embriones de peces con alta multiplicidad y demostramos que cada individuo incorporaba en su
genoma decenas de integraciones retrovirales estables. Una vez que logramos generar la
herramienta que buscábamos, inyectamos embriones y crecimos los peces para evaluar si las
integraciones se transmitían a la descendencia y, si llevadas a la homocigosis, eran mutagénicas.
Fueron 6 meses emocionantes en que observábamos diariamente a los peces creciendo en sus
acuarios esperando el día en que pusieran huevos y pudiéramos buscar un fenotipo en los
embriones. La búsqueda también implicaba genotipar los peces -para evaluar si portaban
inserciones- cortándoles un trozo de la aleta caudal y realizando PCR del DNA obtenido. El
laboratorio se llenó de docenas de bandejas con vasos conteniendo a los peces los cuales debían
esperar el resultado del PCR para que se resolviera su destino. Analizamos alrededor de 80
integraciones sin éxito, lo que puso a prueba nuestra confianza en el experimento, pero
finalmente apareció el primer mutante que pudimos confirmar como efectivamente ligado a una
integración retroviral y que presentaba un fenotipo de degeneración hepática. Luego aparecieron
dos más (de 210 inserciones analizadas) y decidimos enviar un artículo a la revista Nature para
reportar el método y sus resultados. Lo más relevante del artículo fué que, para cada mutante, se
identificó un gen responsable del fenotipo pudiendo asociar al fenotipo una función molecular;
además, los genes fueron clonados en un par de semanas lo que hablaba de la facilidad para
aislar el DNA adyacente a las inserciones virales. El contraste con la tecnología aplicada por
Nüsslein-Volhard fue evidente para los editores de Nature y aceptaron el artículo con pequeñas
modificaciones en 19963. Inmediatamente, enviamos un segundo artículo describiendo en detalle
los fenotipos observados en los mutantes a la revista Genes and Development, el que también fue
aceptado4. Dado el éxito obtenido, nos esforzamos en ampliar la magnitud de la operación de
rastreo de mutantes e instalamos una verdadera fábrica de mutagénesis, especializándose cada
integrante del grupo en una de las tareas del pipeline: producción de virus, inyecciones,
genotipado, búsqueda de fenotipos y caracterización molecular. La frecuencia de mutagénesis
con este método es de 1/100; es decir, de cada 100 integraciones al azar en el genoma, una
interrumpe un gen mutándolo. Se logró producir eventualmente 500 mutantes con sus genes
clonados los que se enviaron al repositorio de pez cebra que maneja la Universidad de Oregon5.
Estos han sido usados por la comunidad científica en investigación de toda índole. Al examinar
ese esfuerzo por parte del grupo de la Dra. Hopkins, reconocemos hoy que fué pionero y
actualizó el modelo al nivel de lo que se estaba haciendo con otros animales y plantas en
modificación genética. Sin embargo, palidece comparado con las tecnologías disponibles hoy
como los transposones, gene y enhancer traps, y la edición del genoma con CRISPR/Cas, que
permite mutar genes dirigidamente en un simple paso.
Terminado mi periodo postdoctoral, me propuse regresar a Chile con la intención de
incorporarme al ambiente académico y llevar conmigo el modelo de pez cebra; en ese momento
no había ningún laboratorio en Sudamérica que lo usara. En el área de la Biología del
Desarrollo, ya existían algunos grupos trabajando en el país y que fueron fundamentales en mi
regreso. En la Facultad de Medicina de la Universidad de Chile, el Dr. Manuel Kukuljan
estudiaba la neurobiología del desarrollo en Xenopus laevis y aceptó recibirme en su laboratorio
como investigador postdoctoral FONDECYT en 1998. Este financiamiento me permitió
continuar con algunos estudios en mutantes que me había traido de Boston y viajar dos o tres
veces al laboratorio de la Dra. Hopkins para continuar involucrado en el rastreo de mutantes. Por
otro lado, tomé contacto con el Dr. Roberto Mayor, discípulo de Luis Izquierdo quien había
fallecido recientemente, y que había regresado de un postdoctorado en Inglaterra. Trabajaba
también en el anfibio Xenopus en desarrollo temprano del sistema nervioso. Roberto le propuso a
las autoridades de la Facultad de Ciencias abrir un concurso para dos cargos de investigadores
jóvenes para formar un grupo de biología del desarrollo y seguir el legado de Izquierdo. Fué así
como me incorporé a la Facultad de Ciencias de la Universidad de Chile al ganar una de esas
posiciones (la otra la obtuvo el Dr. José Luis Gómez-Skarmeta), que asumí de forma completa el
año 2000. Fueron 3 a 4 años de instalación, no sólo del laboratorio sino que de un acuario para
almacenar las diversas líneas mutantes y transgénicas que traje de EEUU. Si bien el manejo de
los peces cebra es sencillo y rutinario, requiere una supervisión constante, lo que acaparó mucho
de mi tiempo en esta fase inicial de mi investigación independiente.
Decidir el tema de investigación al cuál dedicarme en mi propio laboratorio resultó
complejo ya que disponía de mutantes en diversos órganos o procesos y debía seleccionar un
grupo para un análisis más profundo. En mi postdoctorado, había estado dedicado al desarrollo
de tecnologías más que a responder preguntas biológicas, lo que tendría que invertirse si quería
hacer despegar mi laboratorio, obtener financiamiento y atraer estudiantes. Con mi experiencia
del pregrado con el Dr. Inestrosa y de doctorado con el Dr. Weinberg, se instaló la opción de
estudiar el desarrollo del sistema nervioso. En el primer proyecto FONDECYT que presenté,
propuse examinar el desarrollo del órgano pineal y su relación con el desarrollo de la retina ya
que ambos poseen fotorreceptores. Sin embargo, a medio camino de ejecutar ese proyecto, nos
visitó por algunos meses el Prof. Alain Ghysen, de la Universidad de Montpellier en Francia. La
relación con él (que había existido desde muchos años antes por una estadía previa en Chile, a
principios de los ’70) fué fundamental en el rumbo que tomó mi carrera desde el 2003. Alain era
un genetista de Drosophila que había hecho grandes descubrimientos respecto del desarrollo del
sistema nervioso periférico en esa especie. Como otros investigadores que usaban la mosca,
encontraron en el pez cebra (le poisson zèbre) una excusa perfecta para cambiarse a un vertebrado
amigable como modelo de estudio para seguir sus estudios de sistemas sensoriales. Nos presentó a
la línea lateral, un órgano mecanosensor con forma de ordenados botones superficiales en el
cuerpo del pez, que le permite sensar movimientos en el agua circundante. La superficialidad de
los componentes, la presencia de células sensoriales ciliadas (similares a las quetas de la mosca) y
un desarrollo complejo y único, nos convenció que era un sistema ideal para indagar en los
mecanismos genéticos responsables del desarrollo neural. Lo que partió como una colaboración
con Alain terminó englobando a todo el laboratorio y los estudios en este sistema representan
una importante fracción de nuestras publicaciones entre 2007 y 2016. Entre los descubrimientos
importantes efectuados en la línea lateral encontramos un mecanismo molecular que regula la
migración cohesionada y la proliferación de las células que dan orígen al órgano, identificamos
las células que permiten la regeneración de las células ciliadas y del sistema completo luego de un
daño, y caracterizamos el proceso de regeneración axonal que restaura la conectividad cuando el
nervio que comunica las células sensoriales con el cerebro, es cortado. Sin quererlo, el trabajo con
la línea lateral y los mecanismos de su regeneración nos llevaron a explorar otro tema: el de la
inmunidad. Una vez que un tejido es dañado, ocurre una masiva infiltración de leucocitos (que
en la larva del pez cebra son neutrófilos y macrófagos), representando un potente modelo de
inflamación. De a poco, nos hemos ido adentrando en el estudio de estas células, su migración y
su ontogenia, abriéndose una nueva y fascinante línea de investigación en el laboratorio.
Un estimado colega norteamericano, conminado por su director de departamento a
terminar con la dispersión temática de sus proyectos, prometió: “I will focus on everything”. En esa
línea, los últimos diez años han visto pasar por el laboratorio a estudiantes quienes han elaborado
tesis de las más diversas temáticas, pero siempre usando el modelo y los análisis genéticomoleculares
in vivo. Los temas abarcaron desde la neurobiología del desarrollo, la regeneración, la
inmunidad, la toxicidad ambiental, y la regulación transcripcional. Mi estrategia es ofrecer a los
tesistas una gama de herramientas y preguntas abiertas y que ellos diseñen sus proyectos de
acuerdo a sus intereses. En paralelo a la investigación biológica realizada, hemos contribuido de
manera importante a la comunidad que trabaja con el modelo con diversas técnicas de utilidad.
Entre las metodologías introducidas por nuestro grupo estan i) la electroporación de ácidos
nucleicos en células del embrión y la larva; ii) la separación de células por citometría de tipos
celulares específicos y la transcriptómica de ellas; iii) ensayos de inflamación aguda por daño
celular y metodologías de rastreo de drogas; iv) la búsqueda de elementos reguladores en el
genoma y su prueba funcional; v) el uso de electrodos ultrafinos para ablación de células y tejidos;
vi) el transplante de microalgas en los peces; y vii) el transplante de células troncales murinas y
humanas en los peces.
Junto con la investigación realizada, nos preocupamos de hacer ver, urbi et orbi, lo
conveniente que puede ser usar al pez cebra como modelo animal, sobre todo en América
Latina, donde los presupuestos suelen ser limitantes. Al día de hoy, existen alrededor de 10
laboratorios en Chile, y unos 30 en Latinoamérica, que usan al pez en su trabajo experimental.
Ayudamos a fundar una sociedad a nivel del continente6 que ya ha tenido cuatro reuniones y tres
cursos para entrenar y actualizar a los interesados. Además, hemos sido anfitriones de numerosos
estudiantes en pasantía en nuestro laboratorio. Una contribución no menos importante se
relaciona con la proyección de nuestra ciencia y nuestro quehacer hacia la sociedad. El pez cebra
se presta de manera ideal para hacer experimentos o demostraciones visualmente llamativas e
ilustrativas, para personas de cualquier nivel de formación. Hemos trabajado junto a profesores
de escuelas y liceos y hemos logrado que los niños se maravillen con lo que es posible ver en una
simple lupa de disección. El misterio que representa el desarrollo de un organismo a partir de
una y luego unas pocas células indiferenciadas, se revela en tan sólo un día. Al cabo de este
tiempo, se ve un corazón latiendo, células circulando, contracción muscular, órganos y
estructuras que parecen haber surgido de la nada. Que mejor forma para estimular preguntas y
curiosidad acerca de genes, células y la vida misma.
En los años recientes, hemos tenido la fortuna de asociarnos a un grupo de colegas de
primer nivel y obtuvimos, a partir del 2011, financiamiento del programa FONDAP. Creamos el
Centro de Regulación del Genoma7, cuya misión es crear infraestructura y experticia en
genómica y biología molecular e indagar en los mecanismos adaptativos genéticos y epigenéticos
que encontramos en las especies que habitan el desierto y altiplano chilenos. Dentro del espectro
de organismos que hamos examinado bajo este prisma, nuestro grupo ha contribuido con el
estudio de la genómica de peces en relación a la tolerancia a condiciones ambientales extremas.
Comenzar a estudiar organismos silvestres no-modelo (sin una tradición experimental en el
laboratorio) desde el punto de vista molecular tiene sentido en el día de hoy. Estamos viviendo la
revolución que implica la edicición de genomas, tecnología que es utilizable en cualquier especie

y que permitirá contestar preguntas biológicas previamente inaccesibles. El uso de la información
que estamos obteniendo en bacterias, plantas y animales silvestres es también fuente de
conocimiento con aplicación en biotecnología, en una época en que los científicos tendremos que
ser inmensamente creativos para satisfacer demandas productivas y, al mismo tiempo, de
protección ambiental. Queda mucho por hacer aún.

Agradecimientos

Parto por reconocer a los maestros que han influenciado mi formación científica, los Dres.
Inestrosa, Weinberg, Hopkins y Ghysen. No es posible dejar en el agradecimiento exclusivamente
familiar a mis padres, Jorge y Catherine, quienes me enseñaron que esta vocación conlleva una
buena mezcla de altruismo y satisfacción personal. A todos los que han pasado por mi
laboratorio8, les agradezco la confianza y la habilidad para arreglárselas con un tutor tan
disperso. No importa cuán jóvenes sean, si tienen pasión por la ciencia los considero pares y no
súbditos. A las agencias de financiamiento, sobre todo a CONICYT: creo haberme esforzado
para usar bien el dinero de todos los chilenos y haber contribuido con ciencia, formación y
desarrollo; conservemos esta institución y su espíritu de progreso constructivo. A mis colegas de
los diversos centros de excelencia en que he participado, MNDB, CGC, CRG y a los de mi
departamento, facultad y universidad, muchas gracias por estimular un ambiente tan
enriquecedor y que me pueda seguir formando siempre al lado de ustedes. Finalmente a mi
familia, gracias por acompañarme en esta travesía de descubrimiento personal y científico.

REFERENCIAS
1. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. L. Molecular Biology of
Development. 1985.
2. Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio. van
Eeden FJ, Granato M, Schach U, Brand M, Furutani-Seiki M, Haffter P, Hammerschmidt M,
Heisenberg CP, Jiang YJ, Kane DA, Kelsh RN, Mullins MC, Odenthal J, Warga RM,
Allende ML, Weinberg ES, Nüsslein-Volhard C. Development. 1996 Dec;123:153-64.
Mutations affecting the formation of the notochord in the zebrafish, Danio rerio. Odenthal J,
Haffter P, Vogelsang E, Brand M, van Eeden FJ, Furutani-Seiki M, Granato M,
Hammerschmidt M, Heisenberg CP, Jiang YJ, Kane DA, Kelsh RN, Mullins MC, Warga
RM, Allende ML, Weinberg ES, Nüsslein-Volhard C. Development. 1996 Dec;123:103-15.
3. Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish. Gaiano N,
Amsterdam A, Kawakami K, Allende M, Becker T, Hopkins N. Nature. 1996 Oct
31;383(6603):829-32.
4. Insertional mutagenesis in zebrafish identifies two novel genes, pescadillo and dead eye,
essential for embryonic development. Allende ML, Amsterdam A, Becker T, Kawakami K,
Gaiano N, Hopkins N. Genes & Development 1996 Dec 15;10(24):3141-55.
5. Zebrafish International Resource Center; www.zirc.org
6. http://lazen.fcien.edu.uy/
7. www.genomacrg.cl
8. www.zebrafish.cl