Conferencia de Incorporación a la Academia Chilena de Ciencias – Dra. Rosalba Lagos

29-07-21 admin_academia 0 comment

21 de Octubre de 2015

Lucha ancestral entre bacterias: sus armas, una solución terapéutica para el siglo XXI.

Rosalba Lagos

Profesora Titular del Departamento de Biología de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Chile

 

Quiero agradecer a través de su Presidente, a los miembros de la Academia de Ciencias del Instituto de Chile por  el gran honor de invitarme a ser Miembro Correspondiente en Chile de esta Institución. Iniciaré esta presentación haciendo un reconocimiento a todas las personas que hicieron posible que ahora esté aquí recibiendo esta distinción.

 

Agradecimientos

A mi familia:

A mis padres Raúl Lagos y Aurora Mónaco, y a mis hermanos Roberto y Rodolfo por hacer de nuestro hogar un ambiente estimulante para la actividad científica. También a mi suegra Nylda Opazo por  su influencia en mi vida.

A Octavio Monasterio, mi esposo, mejor amigo y compañero en casi todos los emprendimientos de mi vida; a mis hijos David y María Ester  por su compresión y apoyo. A ellos les dedico este nombramiento.

A mis maestros:

A Tito Ureta, quien me enseñó el gusto por la Ciencia, y me contagió, como a muchos otros, su vocación científica. Dirigió mi tesis de Licenciatura en Biología, y mas tarde fue un gran amigo.

A Cecilia Hidalgo, por su genialidad y generosidad, acogiéndome temporalmente en su laboratorio cuando llegué a Boston.

A Richard Goldstein, mi director de Tesis de Doctorado, por su exigencia y máxima libertad en el desarrollo de mi Tesis, que realicé en el Departamento de Microbiología y Genética Molecular, Harvard Medical School.

A Hermann Niemeyer por su generosidad y creer en mi; y a Catherine Connelly por sus consejos y ayuda en la primera etapa de mi carrera científica.

A mis colaboradores

A Octavio Monasterio, co-investigador de todos mis proyectos, quien dirige lo aspectos de mi investigación relacionado con biología estructural.

A Andrés Marcoleta, que está desarrollando un proyecto post-doctoral en mi laboratorio, y que en estos últimos tres años ha sido una pieza fundamental en la investigación y docencia que realizamos en el laboratorio.

A todos los estudiantes que realizaron tesis bajo mi dirección

            Tesis de Doctorado: Marcela Wilkens (1996), Carlos González (1997), Marcelo Baeza (2003), José A. Castillo (2003), Erwin Sthasburger (2005), Gino Corsini (2005), Mario Tello (2006), Verónica García (2008), Gabriela Mercado (2009), Sergio Gutiérrez (2012), Eduardo Bignon (2015) y Pablo Lobos.

            Tesis de Magíster: Mario Leiva (2009), Beatriz González (2011), Paulina Aguilera (2015), Yerko Argandoña (2015) y Gonzalo Díaz

            Memorias de pre-grado: Claudia Orellana (1993), Claudio Hetz (2000), Macarena Marín (2006), Jorge Flores (2009), Daniela Muñoz (2009), Gonzalo Núñez (2012).

Algunos de ellos realizaron su memoria de pre-grado y su tesis de post-grado bajo mi dirección. Todos ellos contribuyeron al trabajo que expondré a continuación

 

Importancia del estudio de bacteriocinas

Hoy en día existe un problema grave con la aparición de bacterias multi-resistentes a antibióticos, pues su uso indiscriminado  ha puesto una mayor presión selectiva para la aparición de un número creciente de bacterias  multi-resistentes. El problema de falta de antibióticos ha quedado de manifiesto estos últimos años, y es así que ya existe una campaña a nivel mundial para desarrollar nuevos antimicrobianos. Sin embargo, el uso de antibióticos también trae aparejado otro problema, y es que después del tratamiento no solo se eliminan las bacterias patógenas sino también a otras bacterias beneficiosas, que son parte de los componentes del microbioma, y estos cambios se asocian a patologías como la obesidad, la diabetes, inflamaciones intestinales, alergias y asma. Esto implica que el problema no se soluciona sólo con la generación de nuevos antibióticos sino con un cambio de estrategia en el combate a las bacterias patógenas.

Una manera de abordar este problema es tratar por diferentes medios que no se altere el equilibrio de las diferentes poblaciones bacterianas que conforman el microbioma. Por ello, estudiar la estrategia ecológica mediante la cual las  bacterias  controlan las diferentes poblaciones bacterianas sin alterar su diversidad puede ser una buena alternativa. Los instrumentos antibacterianos producidos por bacterias son los virus bacterianos, llamados bacteriófagos, y las bacteriocinas. En esta exposición nos centraremos en las bacteriocinas, que son sustancias de naturaleza proteica que tiene un  efecto tóxico sobre otras bacterias. Lo habitual es que las bacterias sensibles a la acción tóxica sean muy parecidas a las bacterias que las producen, por lo que estas sustancias eliminan un rango muy estrecho de bacterias. A su vez, la bacteria productora es inmune a su propia toxina mediante la producción de una proteína que neutraliza a la toxina. La producción de bacteriocinas es un fenómeno generalizado entre las diferentes bacterias, y que contrariamente a lo que se piensa contribuye a que haya un equilibrio de diferentes especies, y no a la  eliminación de una población determinada. Hay un modelo que explica porqué la diversidad se promueve con las bacteriocinas y esto se relaciona con que interactúan de a pares, como el juego papel, piedra o tijera, de modo que la acción de a pares entre bacterias resistentes, sensibles y productoras promueven y no eliminan  la diversidad entre bacterias. Por esta  razón, este último tiempo han aparecido importantes publicaciones discutiendo acerca del uso de bacteriocinas como alternativa a los antibióticos, y también como probióticos.

 

La microcina E492

La bacteriocina que estudiamos en el laboratorio es una microcina, que corresponde a una categoría de bacteriocinas pequeñas (menor de 10.000 Da) y que son resistentes a condiciones extremas de temperatura (resisten ebullición) y pH (activas después de tratarlas con HCl), y resistente a proteasas. Todas estas características las hacen potencialmente útiles para una aplicación biotecnológica. La microcina  de nuestro estudio se denomina microcina E492 (MccE492), que es producida y excretada por la cepa de Klebsiella pneumoniae RYC492, un aislado clínico que se realizó en el Hospital Ramón y Cajal, de Madrid, España. La MccE492 tiene un efecto bactericida sobre otras bacterias relacionadas, como por ejemplo Escherichia coli.

La aproximación genética

Las herramientas genéticas son muy utilizadas en sistemas bacterianos cuando se desea asignar una función, y por ello se empleó esta estrategia para conocer cuantos genes  estaban implicados en la producción de MccE492, y cual es la función específica de cada uno de ellos. Para esto se clonaron y expresaron en E. coli los determinantes genéticos del cluster de la MccE92 localizados en el cromosoma de K. penumoniae. Este DNA se secuenció, se efectuó un análisis bioinformático, y se realizó una mutagénesis generando una colección de cientos de mutantes, dentro de las cuales se buscó la pérdida de función de actividad bactericida. Así, se identificaron los genes que son necesarios para la producción de MccE492 activa, y que los podemos clasificar de la siguiente manera: gen asociado a la producción de la proteína MccE492;  gen asociado a la inmunidad, es decir a la producción de una proteína que neutraliza la acción tóxica de modo que la bacteria que la produce no se autoelimine; genes asociados a la exportación, es decir que son necesarios para que una vez sintetizada la MccE492 produzcan elementos que permitan su salida al espacio extracelular desde donde ejercerá su acción bactericida; genes asociados a la maduración, es decir que se requieren para que la microcina sintetizada tenga actividad bactericida; y genes de regulación, que están asociados a la modulación de la actividad bactericida; (Figura 1).

El mecanismo de acción.

Las bacterias que son sensibles a la MccE492 tienen dos membranas, una externa y otra interna o citoplasmática. La acción de la MccE492 es a través de la formación de poros en la membrana citoplasmática de la célula sensible, que es la verdadera barrera de la célula. Estos poros desestabilizan la membrana, lo que conlleva la salida de metabolitos y otros elementos desde el citoplasma ocasionando la muerte de la bacteria. La formación de poros se caracterizó electrofisiológicamente en bicapas lipídicas utilizando esta proteína purificada, en un trabajo en colaboración con la Dra. Cecilia Vergara. También, mediante liposomas determinamos que el poro está constituido por 5 unidades, es decir se forma con un pentámero de MccE492, y que prefiere el lípido cardiolipina para su inserción.

La exportación

La MccE492 tiene en su extremo amino-terminal un péptido leader que es una señal para la exportación, y que es procesado durante la salida al espacio extracelular. El sistema de exportación consta de tres proteínas: dos codificadas en el clúster que se insertan en la membrana interna (MceG y H), y otra de la membrana externa (TolC), que no está codificada en el clúster. La proteína MceG es un exportador del tipo ABC que requiere de ATP, una molécula que se usa en los procesos energéticos. Las tres proteínas antes mencionadas se ensamblan formando un canal y al momento de la exportación la microcina se procesa (Figura 2).

La maduración

La maduración de la microcina es un proceso muy novedoso que ha despertado la atención de importantes grupos de investigación a nivel mundial, pues implica la adición al carboxilo terminal de la MccE492, que se sintetiza en los ribosomas,  de un sideróforo que es un derivado peptídico sintetizado no ribosomalmente. Un sideróforo es el nombre genérico que reciben las moléculas que capturan hierro soluble con muy alta afinidad para entregarlo en el citoplasma bacteriano. El hierro es el mineral mas abundante de la tierra, pero paradojalmente su biodisponibilidad en las células es escasísima, de ahí que las proteínas o moléculas que acomplejan hierro como una manera de tener hierro soluble al interior de la célula cobran vital importancia, especialmente en la patogénesis bacteriana. La  molécula que específicamente participa en este proceso se denomina salmoquelina, y se sintetiza a partir de otro sideróforo que existe en la bacteria, llamado enteroquelina al que la proteína de la maduración MceC  le adiciona una molécula de glucosa. Este nuevo sideróforo es mas efectivo que su precursor y tiene mucha importancia en procesos de patogénesis.  Las proteínas que realizaban la adición covalente de la salmoquelina al extremo carboxilo terminal de la MccE492 son MceI y J. Otro actor importante en este proceso es la región carboxilo teminal de la MccE492, pues debe ser reconocida por el complejo que realiza la modificación covalente. Mediante mutagénesis determinamos cuales eran los amino ácidos claves para este proceso y también optimizamos esta región para producir una mayor modificación.  Las dos formas de la MccE492, la modificada y la no modificada se exportan al espacio extracelular (Figura 2)

Los receptores y la inmunidad

La función de la modificación de la MccE492 está relacionada con el reconocimiento de la célula sensible. La bacteria que capta sideróforos acomplejados con hierro tiene receptores especializados en la membrana externa, y estos son los que usa la microcina que está modificada. Por ello, la microcina sin modificación es inactiva, pues esta forma es incapaz de reconocer a los receptores. Los receptores bacterianos FepA, Fiu y Cir son reconocidos con una afinidad decreciente por la MccE492. El hecho que sean tres receptores diferentes hace que la probabilidad de aparición de resistentes por mutaciones en los receptores sea prácticamente nula, pues se deberían producir 3 mutaciones simultáneamente. Establecimos además que hay otras proteínas en el periplasma y membrana interna (TonB-ExbBD) que participan en la internalización de la MccE492 y en la correcta inserción de la membrana citoplasmática (Fig. 2). Por otra parte, la proteína de la inmunidad interactúa con los componentes de la membrana que son necesarios para la correcta inserción de la MccE492, previniendo la formación el poro.

La formación de amiloides

Otra característica importante de la MccE492 es su capacidad de formar fibras de tipo amiloide, que poseen las mismas propiedades estructurales, de tinción y morfología que  las fibras amiloides asociadas a patologías como el Alzheimer y Parkinson. Descubrimos que cuando se acumula MccE492 en la fase estacionaria de crecimiento se estimula la polimerización de fibras amiloides (Figura 2). Recientemente hemos descubierto algo inusual, y es que también se forman amiloides intracelulares, que se visualizan como inclusiones cuando se tiñen con sondas específicas para amiloides.  La función del amiloide parece ser inactivar  la actividad bactericida. Por otro lado, la homogeneidad de la morfología de las fibras nos permitió, mediante microscopía electrónica y reconstitución de imagen, usarla de modelo para encontrar la ruta de formación del amiloide. Este trabajo lo hicimos en colaboración con el Dr. José María Valpuesta, del Centro Nacional de Biotecnología, CSIC, España. Así, tenemos la conformación nativa, que puede formar el pentámero, que es el poro de la microcina, o túbulos pentaméricos.  A partir de la conformación nativa se puede inducir la conformación amiloidal, para dar filamentos planos simples, luego filamentos planos dobles, que  dan lugar a la forma helicoidal, que es la forma mas abundante en las fibras.  Los factores que influyen en la formación del amiloide son la fase de crecimiento, pues in vivo en fase estacionaria se acumula la microcina, tanto intra como extracelularmente. Hemos establecido que una mayor proporción de forma modificada retrasa la formación del amiloide, y finalmente hemos identificado una región amiloidogénica, que cuando se delecciona se retarda la amiloidogénesis.  Por el contrario, hemos encontrado residuos que cuando se reemplazan se estimula la amiloidogénesis.

La regulación

La regulación de la actividad de la MccE492 es inusual, por cuanto la mayor actividad se observa en fase exponencial, en tanto que en fase estacionaria se agrega formando amiloides y se pierde la actividad. La actividad puede estar regulada por la expresión de la propia microcina y de los genes de la maduración. La expresión de MceI y MceJ, proteínas necesarias para la maduración, está regulada por hierro a través del represor  Fur que se activa en su presencia, de modo que la disponibilidad de hierro regula la actividad a través de la modificación. Por otro lado, la cantidad de MccE492 producida se ve aumentada en fase estacionaria por la activación de un promotor interno al gen de inmunidad. Esto implica que en fase estacionaria se produce una mayor cantidad de microcina desde un segundo promotor, y comparativamente poca inmunidad. Sin embargo, la formación del amiloide intracelular convertiría a la MccE492  en una forma no tóxica, lo cual compensaría la baja en la proteína de la inmunidad.

La estructura modular

Los estudios mencionados anteriormente permiten deducir que la MccE492 tiene una estructura modular. En el amino terminal se localiza el péptido leader que dirige la exportación de la MccE492. A continuación, se encuentra el módulo tóxico que es el que se inserta en la membrana,  y finalmente el carboxilo terminal, que es el módulo donde se produce la modificación,  necesaria para la captación de la MccE492. Estas propiedades le confieren a la MccE492 un potencial en la aplicación de antibióticos de nueva generación, pues con  cada uno de estos módulos es posible diseñar moléculas híbridas. La región carboxilo terminal es ideal para el diseño de moléculas que pueden ser reconocidas por los receptores que están implicados en la internalización del hierro. Esta estrategia se llama de caballo de Troya, pues se la toxina ingresa a través de un receptor necesario para la captación de un elemento esencial “engañando” a la bacteria. Adicionalmente se puede usar la región tóxica para el diseño de un potente antibiótico, considerando su resistencia a condiciones extremas de pH y temperatura.

Las propiedades anticancerígena

Todas las formas de la MccE492, modificada, no modificada y amiloidal, tienen un efecto tóxico sobre células tumorales, a través de un mecanismo de inducción de apoptosis. Esto último es una propiedad muy importante para su potencial en cáncer, pues la muerte por apoptosis no produce una respuesta inflamatoria

La isla genómica y  su movilidad

Secuenciamos el genoma de la cepa de K. pneumoniae productora de la MccE492 y descubrimos que el clúster está en una isla genómica, la cual resultó ser móvil, es decir que se puede escindir y entrar a otro genoma. Esto tiene importantes consecuencias evolutiva, pues significa que puede haber transferencia horizontal del clúster.

Una nueva microcina

Mediante nuevas construcciones genéticas descubrimos que en el clúster de la MccE492, existe otra microcina con su respectiva inmunidad (OrfL y MceM respectivamente, Figura 1). Hemos determinado que esta microcina se modifica utilizando la maquinaria de la MccE492, que usa los mismos receptores para su ingreso, y que forma amiloides tanto in vivo como in vitro. Su papel parece ser nucleador de la formación de amiloides.

Lo que viene

Muy recientemente han aparecido importantes trabajos describiendo un nuevo fenotipo de cepas de Klebsiella pneumoniae hipervirulentas, que forman abscesos hepáticos  y que constituyen un grave problema de salud pública en Sudeste Asiático. Una de las características que tienen en común estas cepas hipervirulentas es llevan la isla genómica con el clúster de la MccE492. Esto abriría una nueva vertiente en el estudio de esta bacteriocina, investigando el papel de la MccE492 en la patogenicidad.

 

 

Leyenda de las figuras

            Figura 1. Organización genética del clúster de la microcina E492. Las flechas grises representan genes a los cuales se les ha asignado una función, en tanto que las blancas son genes de función desconocida. La dirección de la flecha se refiere a la dirección de la transcripción. La línea encima del mapa genético corresponde a la escala de tamaño en kilo bases, y los sitios de restricción son: B, BamHI; E, EcoRI; N, NdeI; C, ClaI; X, XhoI; S, SalI; Sc, ScaI.

 

            Figura 2. Etapas implicadas en la producción, exportación y captación de la microcina E492.  La microcina E492 es sintetizada como un precursor que se modifica post-traduccionalmente en el carboxilo terminal con moléculas de salmoquelina. La modificación post-traduccional requiere de: Proteínas implicadas en la síntesis de enteroquelina representada como Ent; MceC, una glicosiltransferasa que sintetiza salmoquelina  utilizando enteroquelina como precursor; El complejo MceIJ que cataliza la unión covalente de salmoquelina al carboxilo terminal de la microcina E492. Tanto la forma modificada como la no modificada se exportan y procesan  a través del complejo MceG-MceH-TolC.  La acumulación de la forma no modificada induce la agregación de fibras amiloides. 1. La forma modificada es reconocida por los receptores de la membrana externa (FepA, Fiu y Cir), translocada al periplasma y se inserta en la membrana citoplasmática asistida por el complejo TonB (TonB-ExbB-ExbD). 2. La microcina E492 no modificada  no es reconocida por los receptores y no puede translocarse a través de la membrana externa, por lo cual es inactiva. 3. Las fibras amiloides formadas por la microcina E492 no pueden pasar la barrera de la membrana externa.

 



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