Conferencia de incorporación a la Academia de Ciencias de Chile – Dr. Mario Suwalsky Weinsymer

29-07-21 admin_academia 0 comment

CONFERENCIA DE INCORPORACIÓN A LA ACADEMIA DE CIENCIAS DE CHILE

“MODELOS MOLECULARES DE MEMBRANAS CELULARES Y SU APLICACIÓN EN LA RELACION DE ALUMINIO CON LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER”

MARIO SUWALSKY W.

INTRODUCCION

La figura 1 muestra las característicasneuropatológicas de la enfermedad de Alzheimer, para lo cual se compara el cerebro de una persona que padeció de esta enfermedad, en que se observa el grave deterioro de las neuronas, con el de una persona que no la sufrió,

Figura 1. Características neuropatológicas del cerebro

La enfermedad de Alzheimer (EA), también llamada mal de Alzheimer, demencia senil de tipo Alzheimer o simplemente Alzheimer, es una enfermedad neurodegenerativa que se manifiesta como deterioro cognitivo y trastornos conductuales. Se caracteriza en su forma típica por una pérdida de la memoria inmediata y de otras capacidades mentales a medida que las células nerviosas (neuronas) mueren y diferentes zonas del cerebro se atrofian. La EA suele tener una duración media de 10 años después del diagnóstico. Es la forma más común de demencia, es incurable y terminal. Aparece con mayor frecuencia en personas mayores de 65 años.

Por lo general, el síntoma inicial es la inhabilidad para adquirir nuevos recuerdos. A medida que progresa la enfermedad, aparece confusión mental, irritabilidad y agresión, trastornos del lenguaje, y pérdida de la memoria de largo plazo. Gradualmente se pierden las funciones biológicas, las que finalmente conducen a la muerte. Los tratamientos actuales ofrecen moderados beneficios sintomáticos, pero no hay tratamiento que detenga o retrase la enfermedad.

La causa de la EA es desconocida. Las principales hipótesis para explicar la EA, aunque no han sido demostradas, son factores genéticos, traumas craneanos, estrés oxidativo, infecciones, factores ambientales, déficit de la acetilcolina, y el aluminio. La más antigua de ellas, y en la que se basan la mayoría de los tratamientos disponibles en el presente, es la hipótesis colinérgfica, la cual sugiere que la EA se debe a una reducción en la síntesis del neurotrasmisor acetilcolina. Esta hipótesis no ha mantenido apoyo global por razón de que los medicamentos que tratan una deficiencia colinérgica tienen reducida efectividad en la prevención o cura del alzhéimer.

Las características neuropatológicas de la EA incluyen la formación de ovillos neurofibrilares en el citoplasma de neuronas degeneradas, y de placas seniles en el líquido extracelular. Estas consisten en la proteina?-amiloide (A?), una familia de péptidos de entre 39 y 43 aminoácidos.Entre los péptidos más representativos están el A?(1-40) y el A?(1-42). Algunos investigadores creen que estos depósitos de A? son los responsables del deterioro progresivo de las neuronas durante la EA ya que las especies solubles serían capaces de atravesar las membranas de las neuronas. Los A? son productos normales de la ruptura enzimática de la proteína precursora del ?-amiloide (APP) localizada en la membrana celular según se muestra en la figura 2.

Figura 2. Rupura enzimática de la APP

Figura 3. Ubicación de ovillos y placas en neuronas

Hipótesis del aluminio.

El aluminio (Al) es el metal más abundante en la naturaleza, pero no cumple ningún rol biológico.Se utiliza para construir una gran variedad de artefactos, desde menaje de cocina, bicicletas y aviones. También se presenta en envases de bebidas y en forma de sales tales como cloruro, sulfato, fosfatos, hidróxidos y aluminosilicatos, los que entran en contacto con seres humanos.Estas sales se han usado durante siglos para la elaboración de cueros, para teñir telas, y como coagulantes tópicos para detener hemorragias.

En la actualidad encuentran un gran uso en el procesamiento de alimentos. Por ejemplo, el sulfato para colorearlos, aluminosilicatos para ablandarlos, fosfatos como levaduras, y en general, como espesadores, estabilizadores, emulsificantes, buffers, neutralizantes, texturizadores, etc.Otro uso muy extendido es en el tratamiento del agua potable y agua envasada.

Evidencias experimentales sobre la relación entre el aluminio y la enfermedad de Alzheimer.

Se ha encontrado elevadas concentraciones de Al en el cerebro así como en los ovillos neurofibrilares y placas seniles de pacientes con EA.En ciertos animales a los que se les inyecta soluciones de Al en el cerebro se pueden generar lesiones patológicas y efectos clínicos similares a los observados en pacientes con EA.Se ha identificado más de 100 efectos tóxicos diferentes provocados por el Al en niveles moleculares y celulares, muchos de los cuales ocurren en concentraciones posibles de encontrar en cerebros humanos.Algunos estudios epidemiológicos señalan una relación entre la concentración de Al en el agua potable y la EA.

Membrana Celular.

La membrana celular, que es el medio que separa el citoplasma del plasma, está esencialmente constituida por proteínas, lípidos y agua y que cumple una serie de funciones celulares vitales. De este modo, cambios estructurales inducidos por moléculas exógenas pueden producir serios trastornos en sus funciones.

Con el propósito de entender los mecanismos moleculares involucrados en las interacciones de diferentes compuestos con las membranas celulares, cuyas estructuras son extremadamente complejas, nosotros hemos estado utilizando eritrocitos humanos y modelos moleculares constituidos por fosfolípidos que representan aquellos que se ubican preferentemente en las monocapas externas e internas de la mayoría de las membranas plasmáticas. En la figura 3 se muestra esquemáticamente una célula y su membrana celular

Figura 4. Célula y membrana celular

Para entender el problema de determinar la estructura molecular de una membrana celular por difracción de rayos X, se mostrará en la figura 4 un difractograma de un cristal.

Figura 5. Diagrama de rayos X de un cristal

Para obtener un diagrama de este tipo, en que cada punto o reflexión corresponde a un dato, la sustancia debe estar muy pura y sus átomos,moléculas o iones deben estar regularmente distribuidos en las tres dimensiones del espacio. La figura 5muestra el diagrama que se obtiene de membranas de eritrocitos humanos.

Figura 6. Diagrama de rayos X de membranas de eritrocitos humanos.

Como se puede observar, en lugar de cientos de miles de reflexiones que se podrían generar si la membrana fuese cristalina, solo se obtienen escasas bandas difusas. Esto se debe a la presencia de cientos de proteínas y lípidos diferentes y que están irregularmente distribuidos, y a cuyo desorden molecular contribuye el efecto fluidizante del agua, presente en aproximadamente un 50% de su peso. Mediante diversas evidencias experimentales se ha postulado un modelo de membrana celular, el que se presenta en la figura 6.

Figura 7. Representación esquemática de membrana celular.

En este modelo la membrana es una especie de matriz constituida por una bicapa lipídica en la que están insertas las proteínas, representadas por cuerpos voluminosos irregularmente distribuidos. Por otra parte, los fosfolípidos, que presentan un cierto grado de orden ya que yacen en forma aproximadamente paralela, están distribuidos en forma asimétrica, es decir, aquellos ubicados en la monocapa externa difieren de los que están en la monocapa interna. La distribución de los fosfolípidos principales en la membrana de glóbulos rojos humanos se presenta en la figura 7.

Figura 8. Distribución de fosfolípidos en la membrana de eritrocitos humanos

Como se puede notar, en la monocapa externa (plasmática) predominan las fosfatidilcolinas (PC) y esfingomielinas, mientras que en la monocapa interna (citoplasmática) se ubican las fosfatidiletanolaminas (PE) y fosfatidilserinas. Por consideraciones de ordenamiento molecular y razones técnicas se utilizaron modelos moleculares de membranas constituidos por PC y PE. En la figura 8 se muestra la fórmula estructural de estas dos clases de fosfolípidos.

Figura 9. Fórmula estructural de fosfolípidos PC y PE

Estas moléculas están constituidas por largas cadenas acílicas, lo que les confiere un carácter hidrofóbico; por otra parte, constan de cabezas polares por lo que estas moléculas son anfipáticas. A su vez, los grupos polares presentan una carga negativa en los fosfatos y una positiva en los grupos amino terminales por lo que también tienen carácter de ser moléculas zwitteriónicas. Los grupos amino termnales son ⁺NH₃en PE y ⁺N(CH₃)₃en PC. Las estructuras tridimensionales de PC y PE fueron determinadas por difracción de rayos X, para lo cual se utilizó una cámara especial que se muestra en la figura 9, la que permitía un control de la humedad relativa.

Figura 10. Diagrama de cámara de rayos X.

En la figura 10 se presenta el diagrama de rayos X obtenido de multibicapas lipídicas, el que aunque muestra una cierta similitud con el que se obtuvo de membranas de eritrocitos (figura 5), es mucho más rica en reflexiones, las que a su vez están mejor definidas.

Figura 11. Diagrama de rayos X de bicapas lipídicas.

Este tipo de diagramas de rayos X, conocido como diagrama de fibras, permitió determinar las estructuras tridimensionales de varios PC y PE, las que resultaron ser similares según se puede apreciar en la figura 11.

Figura 12. Modelo esquelético de PC y PE.

Sin embargo, ambas moléculas difieren en sus modos de empaquetamiento (Figura 12). Como se puede apreciar, PC presenta espacios altamente polares en los que se pueden ubicar moléculas de agua y de otros compuestos. Por el contrario, las moléculas de PE se empaquetan en forma muy compacta debido a atracciones electrostáticas y puentes-H entre los grupos polare de bicapas vecinas. Para nuestros estudios utilizamos bicapas constituidas por dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) y por dimiristoilfosfatidiletanolamina (DMPE).

Figura 13. Empaquetamiento molecular de DMPC (A) y DMPE (B).

Una vez conocidas las estructuras de las bicapas de DMPC y DMPE, éstas se utilizaron como modelos moleculares de membranas celulares, en particular de la membrana de eritrocitos humanos, para estudiar como diferentes compuestos químicos de relevancia biológica interaccionan con membranas celulares. A continuación se presentan los trabajos que se han publicado.

ARTICULOS PUBLICADOS SOBRELAlNTERACCION DE
BICAPAS LIPIDICAS CON:

Iones Metálicos: Li, Cd, Cu, Zn, Hg, Pb, Al, Au, Fe, Ti, As, Mn, V, Cr.

Pesticidas: DDT, Pentachlorophenol, 2,4-D, Heptachlor, Dieldrin, Chloridazon, Lindane, Hexachlorobenzene, Benomyl, Parathion, Chlorpyrifos.

Drogas:

Antiinflamatorios: diclofenac, ibuprofen, naproxen, mefenamicacid, salicylicacid

Anticancer: tamoxifen, adriamycin, cisplatin, chlorambucil, cytarabine

Antiarrítmicos: asocainoI, quinidine, procainamide

Antibioticos:chlortetracycline,chloramphenicol,gentamycin,penicillin

Anestésicos locales: proparacaine, dibucaine, bupivacaine, benzocaine

Anti-Parkinson, antiepilépticos:phenitoín,carbamazepin,verapamil, chlorpromazine

Extractos de plantas medicinales nativas: murtilla, maqui, amancay, resveratrol,

glicoalcaloides

Se presentará en esta oportunidad el estudio sobre las interacciones de Al y de los péptidos ?-amiloide(1-40) y (1-42) con eritrocitos humanos y modelos moleculares de sus membranas constituidos por bicapas de DMPC y DMPE. Los métodos utilizados fueron difracción de rayos X en las bicapas lipídicas y microscopía electrónica de barrido (SEM) en glóbulos rojos humanos.

RESULTADOS

1.- Difracción de Rayos X

Las figuras 13-15 muestran los efectos estructurales que producen el aluminio, los péptidos ?-amiloide (1-40) y (1-42) a las bicapas de DMPC. Como se puede apreciar en los respectivos diagramas, Al 10 µM induce una profunda perturbación estructural; sin embargo, una perturbación mayor es inducida por esta misma concentración del péptido A?(1-40), y ésta es significativamente mayor la inducida por A?(1-42). Sin embargo, si a la solución de Al 10 µM se le agrega A?(1-40) 1 µM la perturbación estructural de DMPC es completa (figura 16), resultado que igual se obtiene pero con una concentración menor (0.5 µM) del A? (1-42) (figura 17). Se puede entonces concluir que el aluminio potencia la acción nociva de ambos péptidos.

Figura 14. Difractogramas de DMPC incubado con AlCl3.

Figura 15. Difractogramas de DMPC incubado con A?(1-40).

Figura 16. Difractogramas de DMPC incubado con A?(1-42).

Figura 17. Difractogramas de DMPC incubado con A?(1-40) y AlCl₃.

Figura 18. Difractogramas de DMPC incubado con A?(1-42) y AlCl₃.

Figura 19. Difractogramas de DMPE incubado con AlCl3.

Figura 20. Difractogramas de DMPE incubado con A?(1-40).

Figura 21. Difractogramas de DMPE incubado con A?(1-42).

Figura 22. Difractogramas de DMPE incubado con A?(1-40) y AlCl₃.

Figura 23. Difractogramas de DMPE incubado con A?(1-42) y AlCl₃.

Con el fin de comprobar si los efectos estructurales inducidos por el aluminio eran propios de este metal, o si otros metales también producían efectos similares, DMPC y DMPE fueron respectivamente incubados con cloruros de cobre, cinc, y hierro. Los resultados obtenidos se muestran en las figuras 23 y 24.

Figura 24. Difractogramas de DMPC incubado con cloruros de Al, Cu, Zn y Fe.

Figura 25. Difractogramas de DMPE incubado con cloruros de Al, Cu, Zn y Fe.

Según se puede apreciar en ambas figuras, solo el aluminio induce una perturbación estructural a bicapas de DMPC y DMPE.También se ensayaron los efectos de los complejos metálicos A?(1-41) y A?(1-42)con aluminio, cobre, cinc y hierro, cuyos resultados se presentan respectivamente en las figuras 25 y 26.

Figura 26. Difractogramas de DMPC incubado con complejos de A?(1-42) con Al, Cu, Zn y Fe.

Figura 27. Difractogramas de DMPE incubado con complejos de A?(1-42) con Al, Cu, Zn y Fe.

Nuevamente se puede comprobar que solo el complejo A?(1-42) con Al afecta estructuralmente a DMPC. Un experimento adicional por difracción de rayos X consistió en estudiar el efecto del colesterol sobre DMPC incubado con los complejos metálicos de A?(1-42) con Al, Cu, Zn y Fe, cuyos resultados se presentan en la figura 27.

Figura 28. Difractogramas de DMPC incubado con colesterol y los complejos de A?(1-42) con Al, Cu, Zn y Fe.

De acuerdo a los resultados observados, el colesterol es capaz de neutralizar el daño estructural inducido por el complejo del A?(1-42) con aluminio.

2.- Microscopia Electrónica de Barrido (SEM)

La figura 29 muestra glóbulos rojos humanos observados mediante SEM, los que presentan la forma de discos bicóncavos planos (discocitos) de aproximadamente 8 ?m de diámetro.

Figura 29. SEM de glóbulos rojos humanos.

Con el fin de entender los resultados observados, la figura 29 explica esquemáticamente la hipótesis del par-bicapa de Sheetz y Singer.

Figura 30. Hipótesis del par-bicapa.

Según esta hipótesis, si las moléculas exógenas se insertan en la monocapa externa, ésta se expande lateralmente mientras que la monocapa interna permanece prácticamente intacta; como consecuencia se producen protuberancias en la superficie de los glóbulos rojo, con lo que adquieren una forma espiculada (equinocito). Por el contrario, si las moléculas se ubican en la monocapa interna, es ésta la que se expande mientras la externa permanece intacta, adoptando en éste caso los eritrocitos una forma invaginada (estomatocito).

Figura 31. SEM eritrocitos incubados con AlCl₃

La figura 31 muestra que una concentración 1 y 10 µM de aluminio inducen la formación de equinocitos, lo que estaría de acuerdo con la hipótesis del par-bicapa puesto que los resultados por difracción de rayos X señalaron que el aluminio interacciona solo con DMPC, clase de fosfolípido localizado en la monocapa externa de la membrana de eritrocitos. Concentraciones mayores de aluminio producen hemólisis.

Figura 32. SEM eritrocitos incubados con A?(1-40)

La figura 32 también muestra que el péptido A?(1-40) 1 nM y concentraciones mayores induce la formación de equinocitos, lo que demuestra su localización en la monocapa externa de la membrana.

Figura 33. SEM eritrocitos incubados con A?(1-42)

Los resultados señalan que el péptido A?(1-42) también induce equinocitosis.

Figura 34. SEM eritrocitos incubados con AlCl₃ y A?(1-40)

Figura 35. SEM eritrocitos incubados con AlCl₃ y A?(1-42)

Las figuras 34 y 35 muestran que el aluminio incrementa la equinocitosis inducidas por los péptidos A?(1-40) y A?(1-42).

CONCLUSIONES

Los péptidos ?-amiloide son extremadamente tóxicos a nivel de membranas celulares.
Los efectos tóxicos de los péptidos ?-amiloide aumentan en presencia de aluminio, por lo que no puede descartarse al aluminio como un factor importante en la EA.
La presencia de aluminio en alimentos y agua potable puede considerarse un factor de riesgo en relación a la EA.
La evidencia que el aluminio sea un agente causal de la EA es mas factible que cualquier otro factor que se haya propuesto a la fecha.
Sin embargo, es aun discutible si el aluminio es el único responsable de la EA.
Es posible que el aluminio no inicie la EA, pero es un factor que al menos exacerba el proceso degenerativo.
Se puede considerar al aluminio como uno de los factores, junto a otros factores que en combinación con una susceptibilidad genética, sea crucial para originar la EA.

Artículos publicados con relación a Aluminio y la Enfermedad de Alzheimer

– “Interactions of Al(acac)₃, with Cell Membranes and Model Phospholipid Bilayers”

Suwalsky, B. Ungerer, F. Villena, B. Norris, H. Cárdenas and P.Zatta.
Inorg. Biochem.,75, 263-269 (1999)

– “Effects of AlCl₃ on Toad Skin, Human Erythrocytes, and Model Cell Membranes”
M. Suwalsky, B. Ungerer, F. Villena, B. Norris, H. Cárdenas and P. Zatta.

Brain. Res. Bull., 55, 205-210 (2001)

– “Effects of Al(III) Speciation on Cell Membranes and Molecular Models”.

Suwalsky, B. Norris, T. Kiss and P. Zatta
Cord. Chern.Rev. 228, 285-295 (2002).

-“Aluminum(III) as a Promoter of Cellular Oxidation”.
P. Zatta, T. Kiss, M.Suwalsky and G. Berthon.

Coord. Chem. Rey. 228:271-284 (2002).

– “ Aluminum Fluoride Affects the Structure and Functions of Cell Membranes”

Suwalsky,B. Norris, F. Villena, F. Cuevas, P. Sotomayor and P. Zatta.

Food Chem. Toxicol.42, 925-933 (2004).

-“Interaction between Alzheimer`s amyloid-? and amyloid-?metal complexes with cell membranes”
M. Suwalsky, S. Bolognin, P. Zatta.

Alzheimer’s Dis. 17 (2009) 81-90.

– “Aluminum enhances the toxic effects of amyloid ?-peptide on cell membranes and a molecular model”
M.Suwalsky, P. Hernández.

Monatsh Chem. 142(2011)431-437.

-“Physiological cholesterol concentration is a neuroprotective factor against ?-amyloid and ?-amyloid-metal complexes toxicity”.

Granzotto, M. Suwalsky, P.Zatta
Inorg. Biochem. 105 (2011)1066-1072

-P. Zatta and M. Suwalsky.”Aluminum, Membranes and Alzheimer’s Disease”, in “Aluminum and Alzheimer’s Disease” (Ch. Exley, ed.), Ch. 14, pp 279-291, Elsevier, U.K., (2001).

– M. Suwalsky, P. L. Hernández, C.P.Sotomayor, “Aluminum IncreasesToxic Effects of Amyloid ?-peptides on the Human Erythrocyte Membrane and Molecular Models”. In: Metal Ions in Neurological Systems”,(W. Linert and H. Kozlowski, eds.). pp. 125-135, Springer-VerlagWien (2012).

Colaboradores Nacionales

Ana María Edwards, Facultad de Química, Pontificia Universidad Católica de Chile
Pedro Hernández, Facultad de Agronomía, Universidad de Concepción
Fernando Villena, Departamento de Histología, Universidad de Concepción
Sigrid Mennickent, Departamento de Farmacia, Facultad de Farmacia, Universidad de Concepción
Marcia Avello, Departamento de Farmacia, Facultad de Farmacia, Universidad de Concepción.
María José Gallardo, Centro de Optica y Fotónica, Universidad de Concepción.